近期，上海元莘生物合作客户在“Genes”（IF 4.141）发表一篇“The Complete Mitochondrial Genome of Pilumnopeus Makianus(Brachyura: Pilumnidae), Novel Gene Rearrangements, and Phylogenetic Relationships of Brachyura”的文章。本研究中，作者通过高通量测序获得了P. makianus完整线粒体基因组，确定了基因的位置和其碱基组成。通过基因重排和系统发育分析，提高了短尾目动物的分类和系统发育水平。
期刊：Genes（IF 4.141）发表时间：2022年10月DOI:doi.org/10.3390/genes13111943
研究背景
马氏毛粒蟹（Pilumnopeus makianus）是短柄蟹科的一种蟹。虽然近年来许多研究都集中在短尾纲的系统发育上，但该支系的内部关系还远未确定。由于线粒体与真核生物共生的漫长进化史，它们的基因组包含了反映它们作为物种进化的关键信息。线粒体基因组具有进化快、母系遗传、分子结构简单、相对容易获得的特点。一般来说，线粒体重排在无脊椎动物中很常见，包括头足纲、双壳纲和短尾纲。因此，一个完整的线粒体基因组将有助于分析基因重排和确定进化关系。
研究方法
样本采集：样本采自中国浙江省舟山市长治岛，采集了1个P. makianus标本。
技术手段：线粒体基因组测序
测序平台： Illumina HiSeq X Ten
研究结果
1. 线粒体基因组的基本结构和组成
本研究测序组装了P. makianus的完整线粒体基因组序列为15,863 bp，并上传到GenBank（登录号为OM461360）。该线粒体基因组是一个闭合的环状分子，包括13个PCGs、22个tRNAs、2个rRNAs (rrnl和rrns)和一个小的非编码区。
P. makianus线粒体基因组图谱
P. makianus的线粒体基因组序列与其他已鉴定和发表的短尾蟹有共同的特征。轻（L-）链上共有4个PCGs (ND5、ND4、ND4L和ND1)， 8个tRNAs (tRNA-His、Phe、Pro、Tyr、Leu、Val、Gln、Cys)和2个rRNA;其余37个基因位于重（H-）链上。碱基组成如下:35.76% A, 36.5% T, 10.32% G, 17.42%。此外，该线粒体基因组具有较高的AT偏倚(72.26%)。而其GC偏倚和AT偏倚值为负，分别为- 0.256和- 0.01，说明Cs和Ts超过Gs和As。总之，P. makianus线粒体基因组的碱基组成、GC偏倚和AT偏倚以及基因序列长度均与其他种相似。
P. makianus线粒体基因组的组成
P. makianus线粒体基因组结构紧凑，相邻编码基因之间有部分重叠，尽管如此，基因间隔依旧存在。其基因组有21个基因间隔和7个重叠区域（1 ~ 56 bp不等），其中3个蛋白编码基因有代表性的重叠区域(ATP6~COX3之间为1 bp, ND4~ND4L之间为5 bp, ND6~CYTB之间为1 bp)，这些重叠区域在其他蟹类中也很常见。
P. makianus线粒体基因组的核苷酸组成
2. PCGs和密码子使用
P. makianus线粒体基因组中PCGs全长11,066 bp，包括7个NADH脱氢酶(ND1-6和ND4L)、2个ATPases(ATP6和ATP8)、3个细胞色素c氧化酶(COX1-3)和1个细胞色素b (CYTB)。所有13个PCGs都以起始密码子ATN开头(ATA、ATG、ATC和ATT)，大多以TAA或TAG结尾，而CYTB的终止密码子为单个T。不完整的终止密码子是脊椎动物和无脊椎动物线粒体基因中常见的现象。下图显示了P. makianus线粒体基因组的同义密码子使用(RSCU)和氨基酸组成。最常见的密码子是UUA-Leu(2.23)，最常见的氨基酸是Ile (7.0%)， Asn (8.0%)， Phe (8.9%)， Ile(11.0%)。最不常见的氨基酸是Glu (1.3%)， Arg (1.3%)， Asp(2%)和Cys(2%)。
氨基酸的组成
密码子的使用
3. tRNA和rRNA
与其他蟹类一样，P. makianus的线粒体基因组包含22个tRNA基因。这些基因的长度在63 bp (trnC, trnA)~72 bp (trnV)(表1)，tRNA基因的A + T含量为73.11%；此外，它们表现出正的AT偏斜(0.023)和GC偏斜(0.156)。由于trnS1缺乏二氢吡啶（DHU），只有trnS1 (TCT)不能折叠成具有代表性的三叶草二级结构，这种现象在后生动物中也是很常见的。
P. makianus线粒体基因组tRNA的二级结构
在P. makianus基因组中，rrnS和rrnL的大小分别为831 bp和1355 bp，由trnV分隔。12S rRNA基因后面是trnV, 16S rRNA基因位于trnL2 (TAA)和trnV之间。rRNA的A + T含量为76.2%，AT偏倚(0.030)和GC偏倚(0.322)均为正偏倚，说明As和Gs均大于Ts和Cs。
4. 基因重排
研究人员将P. makianus和其它蟹类的MGOs与Brachyura进行了比较。发现Leucosiidae, Matutidae,Portunidae和Oregoniidae四个科的MGOs与Brachyura相同。然而，Pilumnidae, Xanthidae和Majidae都经历了基因重排。与Brachyura相比，P. makianus表现出易位和重复随机丢失。在P. makianus的线粒体基因组中，trnL2已经移动到trnL1和16S之间的位置，由重(H -)链变为轻(L -)链，形成了一个新的基因序列trnL1-trnL2-16S- trnv - 12s - nd1，这可以用TDRL模型解释。
线粒体基因序列提供了令人信服的系统发育信息。前人研究表明，Pilumnidae和Xanthidae亲缘关系密切，甚至可能同属一个科。在本研究中，通过对Heterotremata的MGOs进行评估，我们发现除距离较远的Majidae外，Heterotremata中其他物种的MGOs都发生了基因重排，与Brachyura一致。此外，我们还发现Pilumnidae和Xanthidae发生了不同的重排，这为它们的进化史提供了关键证据。
P. makianus线粒体基因组的基因重排
5. 系统发育关系
在本研究中，作者利用线粒体基因组中13个PCGs的序列建立了短尾蟹的系统发育关系。分析了P. makianus和74个其他短尾目物种，其中P. nigrofascia和P. gracilipes为外群。结果显示，P. vespertilio和E. nipponicus形成了一个高支持度的姐妹支系(BI后验概率PP = 1, ML bootstrap BP = 92%)。P. makianus与这两个种组成了一个高支持度的Pilumnidae类群。Majoidea的物种是短柄蟹中最古老的世系之一，被认为是距离短柄蟹树底部最近的分支。我们的系统发育树证实了这一点。Pilumnidae与Xanthidae聚在一起，并与Panopeidae Portunidae, Matutidae, Leucosiidae和Cancridae等类群形成姐妹关系。以前，Pilumnidae被认为是 Xanthidae的一个亚科；然而，构建Brachyura分子系统发育验证了短尾下目物种形成了一个独立于Xanthidea的独立分支。我们的线粒体基因组证实了这一结果的可靠性，并进一步解释了Pilumnidae 到Xanthidae的分离，因此前者现在被认为是一个独立的科。此外，还从形态学和分子生物学的角度验证了P. makianus的具体分类地位。
系统发育分析
结论
本研究首次对P. makianus线粒体基因组进行了完整的测序和描述。P. makianus的线粒体基因组全长15,863 bp，包括37个基因和一个富含AT的区域，与后生动物的线粒体基因组相同。基因组组成表现出较高的A T偏倚(72.26%)和负的AT偏倚(-0.01)和GC偏倚(-0.256)。与Brachyura的祖先相比，P. makianus的线粒体基因组发生了基因重排，这可以用TDRL模型解释。系统发育树由77个物种组成，并分为两个分支。P. makianus与P. vespertilio和 E. nipponicus亲缘关系最密切，这3种蟹类构成了毛刺蟹科类群。我们还解释了遗传科学家将Pilumnidae 到Xanthidae分离的原因，这些研究结果有助于更好地理解短尾目植物的分类和系统发育关系。